小針 聡 指導教官 祥雲弘文
「目的」
脱窒とは、硝酸塩など一連の酸化窒素化合物が微生物の働きにより、分子状窒素や
亜酸化窒素ガスに還元される現象である。脱窒は窒素の循環において重要な位置を占
め、地球環境の恒常性の維持に寄与しており、生理的には嫌気呼吸としての機能を持つ。
当研究室において、原核生物に固有の能力と考えられてきた脱窒能を持つ真核生物
の存在が初めて確認された。この真核生物は、カビの一種、糸状菌のFusarium oxy
sporum で、硝酸塩から亜酸化窒素まで還元することができる。脱窒系酵素のうち、
硝酸塩から亜硝酸塩へ還元する異化型硝酸塩還元酵素（Nar)は、硝酸同化に働く同化
型硝酸塩還元酵素（Nap)と区別されている。また、Narは粒子画分に膜酵素として存
在するのに対し、Napは細胞質に可溶性酵素として存在する。このNarは吸収スペクト
ルなどの点で原核生物のNarと類似性があることが示されており、糸状菌が脱窒能を
獲得した起源を知る上で、大変興味深い。そこで本研究では、F. oxysporumおけるNa
rの詳細な知見を得るため、単離と精製を試みた。
「方法」
脱窒誘導条件下で培養したF. oxysporum MT-811株を酸化アルミニウムで破砕し、
遠心分離し粗酵素液を得た。これを界面活性剤Triton X-100（２％）で可溶化し、超
遠心分離により可溶化酵素を得た。またTriton X-100では、紫外部に吸収を持つこと
や、透析や濃縮により除去できないなどの欠点を持ち、後の精製が困難になるため、
他の界面活性剤への置換を検討した。この可溶化酵素液から、硝酸塩還元活性を精製
した。陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
により分離、精製をした、更にゲル濾過クロマトグラフィーにより更なる精製を試みた。
活性の測定は生理的電子供与体であるユビキノールもしくはメチルビオロゲンを使
用し、生じる亜硝酸塩の比色定量により測定した。また、精製度の確認は、NativePA
GEにより測定した。
精製の段階ごとにサンプルの、総タンパク量、比活性、回収率を測り精製表を作成
した。
「結果・考察」
界面活性剤の検討。上述の通り、界面活性剤Triton X-100では後の精製が困難な為、
シュクロースモノラウレート、ドデシルマルトシド、オクチルグルコシド、置換無し
（Triton X-100のまま）という４パターンで活性を追った。その結果シュクロースモ
ノラウレート置換で高い活性が見られたので、後の精製にはシュクロースモノラウレー
トを使用した。可溶化にシュクロースモノラウレートを用いると活性が低い（可溶効率が悪い）ので、Triton X-100で可溶化し、後に他の界面活性剤に置換するという方法を用いた。