新奇アダプター複合体AP-4のサブユニット間相互作用の解析

吉田雄作　　　　　　　　指導教官　中山和久

【目的】細胞内のオルガネラ間のタンパク質輸送において、クラスリン 被覆小胞はトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）からリソソームへのタ ンパク質輸送や細胞膜からのエンドサイトーシスに関与する。クラスリン が膜へ結合するのを仲介するのがアダプタータンパク質（ＡＰ）複合体で ある。ＡＰ複合体はアダプチンと呼ばれる２つの大サブユニットと、中鎖 、小鎖のヘテロ４量体であり、これまでに３種類が同定されている。 ＴＧＮからのクラスリン被覆小胞に存在するＡＰ-１、エンドサイトーシ スに関与するＡＰ-２、そしてエンドソームで機能すると考えられるＡＰ -３である。最近、新たなＡＰ複合体ＡＰ−４の存在が示唆され、そのサ ブユニットと思われるβ４-とε-アダプチン、μ4（中鎖）、σ4（小鎖） の４つが同定された。本研究では、この同定された４つの蛋白質間の相互 作用を酵母のtwo-hybrid systemあるいはthree-hybrid systemを用いて 調べ、新奇のアダプター複合体ＡＰ-４の構成を決定した。

【方法】two-hybrid systemは、LacZなどレポーター遺伝子の発現を指標にしてタンパク質間の相互作
用の有無を検出する方法である。まず,LacZの転写因子であるGal4のDNA結合領域と目的の遺伝子（ε-ア
ダプチン、ε-アダプチンとσ-４）を組み込んだ発現ベクター（bait）と、Gal4の転写活性化領域に目
的の遺伝子（ＡＰ複合体の各サブユニット）を融合した発現ベクター（prey）を構築した。次に、酵母
に２種類のベクター（baitとprey）をco-transformし、トリプトファンとロイシンを欠如した培地で培
養した。生育したコロニーを液体培養し、o-Nitrophenyl-β-galactopyranoside（ONPG）を基質として
β-galactosidase（LacZの遺伝子産物）の活性を測定した。目的とするタンパク質間の相互作用がある
と、Gal4がDNA結合と転写活性化の両方の能力を持つことになり、LacZの転写因子としてβ
-galactosidaseの生成を促進する。生成されたβ-galactosidase活性を調べることで相互作用が検出で
きる。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　
　　
【結果と考察】baitにε-アダプチンを使ったtwo-hybrid systemでは、ε-アダプチンはσ４と特異
的な相互作用を示し、共にAP-4に含まれると考えられるβ４-アダプチンや、他のアダプター複合体のサ
ブユニットであるσ１やσ２とは相互作用をしなかった。ところが、baitにε-アダプチンとσ４を使っ
たthree-hybrid systemにおいて、ε-アダプチンはσ４を介在させることによりβ４-アダプチンと特
異的に相互作用をした。また、β４-アダプチンとμ４が相互作用するというデータも他の研究室から
出ており、これらのことからβ４-とε-アダプチン、μ４、σ４は特異的に集合して相互作用をしあい、
ＡＰ-４を構成しているということが示された。
今後は新奇のアダプター複合体AP-4が細胞内で実際にどのような輸送課程に関与しているのかを解明し
ていきたい。

☆タイトル集に戻る
☆一つ前の要旨を見る
☆次の要旨を見る
☆タイムテーブルを確認する