ES細胞を用いた異種ミトコンドリア導入による病態モデルマウスの作製

980771 笠原敦子　　　指導教官　中田和人

＜導入・目的＞
　ミトコンドリアは酸化的リン酸化によってATP合成を行う細胞内小器官であり、その内部には独自のゲノムであるミトコンドリアDNA(mtDNA)が存在している。特定の欠失突然変異や点突然変異型mtDNAsの蓄積はミトコンドリア呼吸機能の低下を招き、ミトコンドリア病と総称される様々な病態を引き起こすことが知られている。しかし、このような突然変異型mtDNAの蓄積による病態発症機構は未だ不明な点が多い。ミトコンドリア病の病態発症機構を解明するためには、mtDNAの突然変異が原因でミトコンドリア呼吸機能低下を示すような病態モデルマウスの作製が必須である。当研究室の先行研究において、病原性欠失突然変異型mtDNAを導入した病態モデルマウス (mito-mouse)の作出に成功しているが、この方法では、細胞質融合法によってミトコンドリアごと欠失突然変異型mtDNAをマウス受精卵に導入するため、新たな病態モデルマウス作製のためには、点突然変異型mtDNAまたは、何らかのmtDNAの異常を持った細胞を見出す必要がある。当研究室の先行研究において、マウス由来の核ゲノムとラット由来のミトコンドリアゲノムを持つサイブリッド細胞では、呼吸活性の著しい低下が観察されている。そこで、本研究ではラットmtDNAをマウスES細胞に導入してキメラマウスを作製することによる新たなミトコンドリア病モデルマウスの作製を目的とした。

＜方法＞
　既にミトコンドリアを消失させる事が報告されているRhodamine-6G(R6G)をマウス ES細胞(TT2-F,XOタイプ)に処理し、このES細胞と脱核したラットの細胞質体をポリエチレングリコール存在下で融合させ、1週間後にラットmtDNAが導入されたマウスES細胞をクローニングした。導入されたラットmtDNAはPCR法とサザンブロット法によって確認した。コントロールとして、マウス(Musmusculus domesticus)の別種である M.spretusのmtDNAをもつES細胞も同様の方法で作製した。これらのES細胞をマウス８細胞期胚に注入し、キメラマウスの作製を試みた。

＜結果・考察＞
　ラットのmtDNAを導入したES細胞では、導入後1週間目では確かにラットmtDNAが検出されたが、さらに1週間培養すると、導入したラットmtDNAはPCR法でのみ検出された。即ち、ラットmtDNAをマウスES 細胞に導入しても、培養を続けるとそのコピー数が減少してしまう事が明らかとなった。この原因として、マウスES細胞に対するR6G の処理が不十分なため、ES細胞内にマウスmtDNAを持つミトコンドリアが残存し、それによって外来のラット由来のミトコンドリアが席巻されてしまうと予想される。そのため、ラットmtDNAをマウスES細胞に導入するためには、マウスES細胞内のミトコンドリアをR6G処理によって完全に消失させなくてはならないと考えられる。現在、その処理条件について検討中である。一方、コントロールのM.spretusのmtDNAを導入したマウスES細胞を用いたキメラマウスの作製には成功し、かつそのキメラマウスの仔も誕生した。この事は、M.spretusのmtDNAを導入したマウスES細胞が生殖細胞系列への分化能を保持していることを示している。