突然変異ミトコンドリアDNAを導入したヒト神経芽腫細胞の細胞生物学的解析

糸井千恵　指導教官：中田和人

【導入・目的】
　ミトコンドリアは生命活動に必要なエネルギーであるATPを産生する細胞内小器官であり、その内部には独自の遺伝情報であるミトコンドリアDNA（mtDNA）が存在している。mtDNAはヒストンのような保護タンパク質や障害の修復機構を欠いており、ミトコンドリア内ではATP産生過程で生体にとって有害な活性酸素種も産生されるため、mtDNAは核DNAに比べ突然変異が蓄積しやすいと考えられている。近年、ミトコンドリア脳筋症や、神経細胞特異的な細胞死によって発症するアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患において、突然変異mtDNAの蓄積や呼吸鎖酵素活性の低下が報告されている。このような結果は、ミトコンドリア機能異常が病態の発現に関与することを示唆している。そのメカニズムとして、突然変異mtDNAの蓄積が呼吸鎖酵素活性の低下を引き起こし、さらにこのミトコンドリア機能異常が神経細胞死を誘発する可能性が考えられる。
　そこで本研究では、ヒト神経芽細胞に病原性欠失突然変異mtDNA（ΔmtDNA）を導入し、ミトコンドリア呼吸機能の低下とアポトーシス誘導の関係について調べることを目的とした。

【方法】
　細胞質移植法を用いてヒト神経芽腫細胞株（SHSY5Y）にΔmtDNAを導入した Cytoplasmic hybrid（Cybrid）細胞を実験材料とした。さらにこのCybrid細胞をリクローニングし、様々な割合でΔmtDNAを含有するCybrid細胞を単離した。そしてこれらのCybrid細胞のミトコンドリア呼吸機能の指標として、呼吸鎖酵素の1つであるシトクロームcオキシダ－ゼ（COX）の活性を測定し、且つ、ヘキスト染色によってアポトーシスの特徴である核断片化を検出した。

【結果・考察】
　85％のΔmtDNAを含有するCybrid細胞のCOX活性は、コントロール（ΔmtDNAを含有しないCybrid細胞）のそれと比較して20％程度まで低下していた。ヘキスト染色では、ΔmtDNAの蓄積によってCOX活性が明らかに低下したCybrid細胞でさえ核の断片化は観察されなかった。
　これらの結果は、神経芽細胞ではΔmtDNAの蓄積によってミトコンドリアの呼吸鎖酵素活性が顕著に低下するが、このミトコンドリア機能異常が神経芽細胞に細胞死を誘導しないことを示している。しかし、今回用いた神経芽細胞は神経細胞として分化させていないため、アポトーシス誘導に対して抵抗性を示したという可能性も考えられる。
　今後は、ΔmtDNAを導入したCybrid細胞におけるΔmtDNAの含有率と神経細胞死の関係をさらに詳細に検討することを考えている。また、アポトーシス抵抗性の可能性を検証するためにCybrid細胞を神経細胞として分化させ、この細胞におけるΔmtDNA の蓄積とミトコンドリア呼吸機能低下がアポトーシス誘導に与える影響についても解析する予定である