ニワトリ後肢筋におけるトロポニンＴの発現

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　丸山賢治　　　指導教官　平林民雄

＜導入、目的＞

筋は中胚葉誘導に始まり、MyoD、Myf5による決定を経て、myogeninによって分化する。このように筋形成の分子機構の概要は解明されているが、各筋が組織特異的なアイソフォームを発現し、特有の収縮特性を得る過程についてはほとんど明らかにされていない。当研究室ではこの過程を明らかにするためトロポニンＴを分子マーカーとして用いた研究が進められてきた。トロポニンＴは筋収縮調節タンパクの一つであるトロポニン複合体のサブユニットであり、速筋型トロポニンＴ、遅筋型トロポニンＴ、心筋型トロポニンＴに大別される。それらは各異なる遺伝子によってコードされている。速筋型トロポニンＴ遺伝子は選択的スプライシングにより多くのアイソフォームを生み出す.これらのアイソフォームは発現する組織の違いによりBreast type(B-type)とLeg type(L-type)に分類されている。当研究室において、ニワトリ前肢筋では基部側ほどB-typeの発現が強く、先端部側ほどB-typeの発現が弱くなり、L-typeは逆に基部側ほど発現が弱く,先端部側ほど発現が強くなるということが示された。さらに、この発現の差は神経刺激、位置情報などの外的な影響によるものではなく、筋線維を作り出す筋芽細胞の細胞系列の違いによることが示された。

本研究では、ニワトリ後肢筋（大腿二頭筋、長腓骨筋、腓腹筋）の基部と先端部におけるトロポニンＴアイソフォームの発現パターンを調べた。前肢筋では速筋型トロポニンＴのみが発現しており、形成される発現の差は選択的スプライシングの調節によるものである。一方、後肢筋の腓腹筋、長腓骨筋では速筋型と遅筋型トロポニンＴが発現している。本研究では、基部と先端部の間で後肢筋にも前肢筋と同じような選択的スプライシングの調節による発現の差が見られるかを検証し、さらに遅筋型トロポニンＴの基部と先端部における発現を調べ、転写調節により発現の差が形成されているかどうかを示すことを目的とした。

＜方法＞

　ニワトリ後肢筋（大腿二頭筋、長腓骨筋、腓腹筋）の基部と先端部からそれぞれ筋肉を切り出し、尿素抽出液を用いてタンパク質を抽出した。それらのタンパク質を二次元電気泳動法により展開し、ウエスタンブロッティングを行うことにより、速筋型トロポニンＴを検出し、腓腹筋、長腓骨筋については同様に遅筋型トロポニンＴの検出を行った。

＜結果、考察＞

　大腿二頭筋における速筋型トロポニンＴは、基部と先端部で発現の差は見られず、両部位でL-typeアイソフォームとB-typeアイソフォームが共に発現した。長腓骨筋における速筋型トロポニンＴは、両部位でL-typeアイソフォームの発現の差は見られなかったが、B-typeアイソフォームは基部で強く発現し、先端部では弱く発現するという差が見られた。遅筋型トロポニンＴは両部位で発現し、差は見られなかった。腓腹筋における速筋型トロポニンＴは、両部位でL-typeアイソフォームとB-typeアイソフォームが共に発現し、両部位で発現の差は見られなかったが、遅筋型トロポニンＴは基部ではほとんど発現せず、先端部では強く発現するという差が見られた。

　今回、長緋骨筋においても、前肢筋と同様に選択的スプライシングによって調節される速筋型トロポニンＴの発現の差が見られることが示された。また、腓腹筋においては遅筋型トロポニンＴの発現が基部と先端部で異なり、一つの筋肉内で転写調節により発現の差が形成されていることが示された。

　今後は、今回示された発現の差が何によって生み出されているものなのかを検証する。前肢筋の選択的スプライシングの調節による発現の差は、各部位の筋線維を形成する筋芽細胞の違いによって形成されることが示唆されているが、後肢筋の選択的スプライシング調節、また、転写調節による発現の差も同様に筋芽細胞の違いによるものなのかをしょう尿膜上組織培養、細胞培養実験により明らかにする。また、腓腹筋では基部と先端部で速筋型トロポニンＴのエクソン１６と１７の選択的スプライシングのパターンがmRNAレベルで異なることが明らかになっている。このことがタンパクレベルでも言えることなのかを明らかにし、さらにその選択的スプライシングの調節に影響を与える因子について検証する。