つくば生物ジャーナル Tsukuba Journal of Biology (2004) 3, XX (C)2004 筑波大学生物学類
グラム陽性細菌の遺伝子組換えに関する研究
石川 拓也 （筑波大学 生物学類 ４年） 指導教官： 小林 達彦 （筑波大学 応用生物化学系）
【目的】
難分解性化合物分解能が高い微生物として知られ、その能力を活用し環境浄化のみならず有用物質の工業生産にも利用されており、さらに、有機溶媒耐性と強い酸化還元能を有する為、特殊なバイオプロセス環境下における活用が期待されているグラム陽性細菌がある。一方、本研究室ではこれまでグラム陽性細菌を対象としてニトリル代謝関連酵素をタンパク質・遺伝子両レベルで基礎解析を行うとともに、有用物質生産研究を行ってきた。それらの知見を基に、本研究ではグラム陽性細菌を用いた遺伝子組換えに関する研究を行うことにした。
【方法・結果】
まず、グラム陽性細菌のベクター系を開発する為に必要なグラム陽性細菌で複製するプラスミドを検索した。国内外の微生物保存機関よりグラム陽性細菌を購入し、常法に従いプラスミド抽出を行い、アガロースゲル電気泳動を行うことによって、プラスミド保有株のスクリーニングを行った。スクリーニングの結果から判明したプラスミド保有株について大量培養を行った。大量調製したプラスミドを用い、制限酵素処理による断片化とアガロースゲル電気泳動による分画によってプラスミドサイズについて検討を行った。最も小さいプラスミドを対象に、制限酵素処理を行うことによってプラスミド地図を作成した。続いて、様々な制限酵素断片を大腸菌で複製するプラスミドに連結しシャトルベクター候補を作成した。現在、構築したシャトルベクター候補を用いて、エレクトロポレーション法によりグラム陽性細菌の形質転換を行っているところである。このようなストラテジーで選択した菌株・プラスミドを用いることで、グラム陽性細菌による遺伝子組換え系の開発を行っている。