つくば生物ジャーナル Tsukuba Journal of Biology (2004) 3, XX (C)2004 筑波大学生物学類
プラストキノン生合成阻害剤のニンジン培養細胞への影響と酸化ストレス発現
小島 安紀子 （筑波大学 生物学類 ４年） 指導教官： 松本 宏 （筑波大学 応用生物化学系）
＜背景＞
除草剤ピラゾレートは感受性植物の新葉に白化症状をおこして枯死させる。ピラゾレートの活性本体はこれが加水分解して生成される脱トシルピラゾレート（DTP）である。DTPはプラストキノン合成系の酵素の一つである4-ヒドロキシフェニルピルビンサンジオキシゲナーゼ（4-HPPD）を阻害するため、プラストキノン合成を停止させる。その結果カロチノイド合成系が間接的に阻害されるため、ピラゾレートを処理された植物は色素を作れず、白化枯死すると考えられている。しかし、枯死に至る過程は、カロチノイド合成系の阻害以外にも、プラストキノン自体の欠損、抗酸化物質であるビタミンEの合成停止などの影響も考えられ、詳細にはわかっていない。
また、プラストキノンの酸化還元状態は、核や葉緑体の遺伝子発現に関わっていることが明らかになりつつあり、除草剤を遺伝子発現の制御剤として利用できる可能性がある。
＜目的＞
4-HPPDが阻害されてから枯死に至る原因を調べる。また新規化合物で白化症状をおこすホスホノスリキシンの4-HPPDへの影響を調べる。
＜方法＞
供試植物：ニンジン培養細胞（Daucus carota L.）
MS培地100mlに細胞濃度が2%になるように細胞培養液を加え、25℃、弱光
100rpmで10日間、振とう培養する。
１．４-HPPDの阻害実験
ニンジン細胞から4-HPPDを抽出し、濃度を調整した薬剤を添加する。反応産物であるHGAをHPLCで測定する。
２．ニンジン細胞の生育阻害・回復実験
MS培地100mlに細胞培養液20mlを加え、さらに所定の終濃度となるように調整した薬剤5mlを添加する。また、回復効果を示す可能性がある物質としてHGA、ビタミンEを添加する。細胞の成長量をPCVで、カロチノイド量を吸光度で測定する。
＜結果・考察・今後の展開＞
DTPは10μMでニンジン細胞の生育阻害を起こした。ホスホノスリキシンではほとんど阻害が見られなかった。これは、DTPでは4-HPPDを阻害し、一方、ホスホノスリキシンでは細胞に吸収されなかったか、もしくは酵素を阻害しないため、と考えられる。回復実験は行っていないで、枯死の原因は検討中である。
今後は、薬剤による4-HPPDの阻害確認、ニンジン細胞の回復実験を行い、枯死の原因を調べる。また細胞レベルから植物体レベルに移して、除草剤の阻害効果を4-HPPD活性測定やカロチノイド含量、抗酸化酵素の活性測定などで調べる。さらに、プラストキノンの定量を行い、枯死の原因の追求、また、除草剤によるプラストキノン量の増減で、核や葉緑体内の遺伝子発現がどのように変化するか調べていく予定である。