丸山 泰 （筑波大学 生物学類 ４年） 指導教官： 古久保−徳永 克男 （筑波大学 生物科学系）
● 背景・目的
近年の分子神経生物学の展開により，脳の発生は，進化の過程で高度に保存された形態形成遺伝子群により支配されていることがあきらかにされてきた。嗅覚情報処理系においても，脊椎動物と無脊椎動物の両者に共通する解剖学的，発生学的な類似性が報告されている。昆虫における嗅覚一次中枢である触覚葉は，触覚神経，投射神経，局所介在神経の 3 種類のニューロンからなる。各々の神経網は糸球体と呼ばれる構造単位を形成している。単一の触覚神経は，匂い物質を感知する嗅受容体を一種類のみ発現し，単一の糸球体には同一の嗅受容体を発現する複数の触覚神経が集まる。匂い情報は，触覚神経によって触覚葉に伝達されたのち，投射神経により，キノコ体などの高次処理中枢に運ばれる。また局所介在神経は，触覚葉において糸球体間の調節をしている。昆虫における触覚葉，触覚神経，投射神経，局所介在神経は，哺乳類における嗅球，嗅神経，僧帽細胞，顆粒細胞などに対応し，嗅覚情報のマッピングも同様のメカニズムからなることが知られている。このような事実から，昆虫の嗅覚中枢を調べることにより，我々ヒトを含む多くの動物に特徴的な嗅覚中枢の構造，機能を知る重要な手がかりが得られると期待される。
本研究は，高度な遺伝学的手法が導入できるキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）をモデルに用いて，触覚葉の発生機構を探索することを目的とした。ショウジョウバエの触覚葉は，胚期における頭部神経節 b2 から生じることが知られており，この b2 神経節では ギャップ遺伝子の一種であるems（empty spiracles）遺伝子が発現している。ems 遺伝子はホメオドメインをもつ転写因子をコードし，哺乳類におけるEmx遺伝子と相同である。ems 遺伝子を欠損したハエでは，胚期においてb2神経節が形成されず，脳構造に異常が見られることが先行研究により報告されている。しかし，ems 遺伝子が幼虫期，成虫期の触覚葉やその他の脳構造の構築にどのような関わりを持っているかは未だわかっていない。そこで，幼虫，成虫の触覚葉周辺の神経細胞におけるems 遺伝子の発現パターンを解析し，ems 遺伝子を発現する神経細胞の投射先を詳しく追うことにした。
● 材料・方法
・GAL4-UASシステム ＆ MARCM法の利用
酵母の転写因子 GAL4 がＰ因子によってゲノム中に挿入されたエンハンサートラップ系統と，GAL4のターゲットであるUAS配列と蛍光色素GFPの遺伝子をもった系統を用意する。これらを交配すると，挿入されたGAL4近傍の遺伝子を発現する細胞をGFPで可視化できる。本実験では，中枢神経系の広範囲を可視化できるelav -GAL4エンハンサートラップ系統を用いた。また，神経細胞を一個単位でマークし，細胞体がどの位置にあり軸索がどこに投射しているのかを詳しく見るために，モザイク解析の一種であるMARCM法を用いた。この方法は，組換え酵素をhsp70プロモーターによって発現し，人為的に染色体組換えを起こすことで，レポーター遺伝子が働く細胞と働かない細胞とを発生中の脳の中に作ることができるものである。
・抗体染色，顕微鏡観察
GFPでマークされた神経細胞においてems 遺伝子が発現しているかを判定するために，emsタンパクの抗体を用いて抗体染色を行った。また，マークされた神経細胞の投射先がわかるように，神経網構造を網羅的に染色できるnc82抗体を同時に用いた。抗体染色したサンプルは共焦点レーザー顕微鏡で観察し，神経構造の三次元的な解析を行った。
● 結果・考察・展望
幼虫期には，触覚葉周辺の表層部にems 遺伝子を発現する細胞群が数個存在することが確認された。これらのems 陽性の細胞群は，束になった軸索を脳の内側に向けて伸ばし，細胞群ごとに別々の投射先が存在することが確認された。成虫期においては，ems 遺伝子の発現は位置的により限定され，触覚葉と食道下神経節（SOG：味覚に関する神経が集まる場所）の境目に位置する細胞群で発現していることが確認された。ems 遺伝子を発現する神経細胞の中には触覚葉に投射するものがあると予想されたが，確認できた投射先は食道下神経節であった。さらに，幼虫と成虫において食道下神経節に投射するems 陽性の細胞群を詳しく観察したところ，高次中枢であるキノコ体にもつながっている可能性が見出された。
ems 遺伝子を発現する細胞で，触覚葉に投射するものは，幼虫期，成虫期ともに確認されなかった。また，幼虫期に確認できたems 陽性の細胞群の中には，成虫期に確認できないものがあった。恐らくems 遺伝子の発現のいくらかは蛹期に消失すると考えられる。触覚葉の形成には胚期におけるems 遺伝子の発現が不可欠であるため，今回得られた結果から 2つの可能性が示唆される。 1つは，ems 遺伝子のシグナル伝達系の下流に何らかの遺伝子が存在し，それが細胞分裂ののちに触覚葉を構成する細胞で発現するであろうということ。もう 1つは，ems 遺伝子の発現がある段階で抑えられると細胞が分化し，触覚葉を構成する細胞になるであろうということである。
今後，ems 陽性の神経細胞の発生，分化，投射パターンなどをより詳細に解析するために，ems 遺伝子の発現に連動してGAL4を発現するems -GAL4系統を作成する予定である。また，ems 遺伝子完全欠損変異体は，幼虫にならず死んでしまうので， MARCM 法を用いてモザイクミュータントを作成し，ems 遺伝子のloss-of-function解析を行う予定である。さらに，ems 遺伝子上流域にUAS配列を持つUAS- ems 系統とGAL4エンハンサートラップ系統とを交配して，ems 遺伝子のgain-of-function解析を行う。