細胞性粘菌Dictyostelium discoideumの集合期特異的遺伝子の解析

〈目的〉　細胞性粘菌D. discoideumは、単細胞と多細胞の生活環を持つ真核生物である。分裂増殖していた単細胞は、飢餓を引き金に集合してストリームと呼ばれる渦状の細胞集合塊を形成、マウンド、移動体と呼ばれる形態を経て、胞子と柄からなる子実体となる。この過程では細胞の融合は見られず、無性発生と呼ばれている。
　細胞性粘菌の無性発生は、増殖期と分化期が明瞭に区別され、胞子と柄からなるシンプルな分化パターンを持つことから、多細胞体の構築メカニズムの解析に広く使われてきた。多細胞体形成の初期に見られる細胞集合の時期に特異的に発現している遺伝子を解析することで、細胞分化のメカニズムを探っていく。
　また、細胞性粘菌には細胞が融合し遺伝子の組換えが起きる、有性発生と呼ばれる生活環も存在する。水分過剰・暗条件下で融合能を獲得した細胞をFC(fusion competent)細胞といい、細胞融合でできた2nの接合子が、周囲の細胞を集合させて、消化・吸収してできる膜で包まれた休眠構造体をマクロシストという。マクロシスト形成は、不完全ではあるが、配偶子形成、細胞融合、遺伝子組換えが起きていることから、受精の原始型だと考えることができ、その解析は、より複雑な生物の受精メカニズムの解明という点においても重要だといえる。
　また、異なる発生様式において、細胞集合に関する分子がどのように使い分けられているのかを調べることで、発生の新たな分子メカニズムの解明につなげていく。

〈方法〉　細胞性粘菌のゲノム配列(3,400万塩基対：ヒトの約1/100)は、アメリカやヨーロッパを中心に解読が進められ、そのデータはインターネットで公開されている。日本では、発現している遺伝子の網羅的解析を目指したcDNAプロジェクトが進められており、増殖期、集合期、形態形成期、移動体期の4つの時期とFCの各細胞からmRNAを単離・クローン化して遺伝子ごとにまとめた、cDNAライブラリーが公開されている。
　まず、解析の対象とする遺伝子を決定するため、これらのデータを利用して、以下の条件で絞り込みを行った。

1. 集合期での発現比が高い(cDNAライブラリーにおける集合期のクローン数の比率≧60％)
2. 集合期での発現量が多い(集合期のクローン数≧5)

―集合期に多く発現している遺伝子は、集合期で重要な働きをしているだろうという考えから
3. FC細胞でのcDNAクローンがある

―有性発生と無性発生の細胞集合を比較するため
4. 遺伝子のサイズがあまり大きくない(塩基長≦1800bp)

―分子の解析を容易にするため

1. 細胞の大きさが、KAX3に比べて小さかった。
2. 液体栄養培地中の振盪培養で、増殖速度が遅かった。
3. 液体栄養培地中の振盪培養で、増殖が停滞する細胞密度がKAX3では約2.4x10⁷cells/mlであったのに対し、krsA^-では約6.0x10⁶cell/mlと低かった。
4. 寒天培地上での餌であるバクテリアとの培養で、コロニーの広がりが若干早く、KAX3にはないコロニーのふちから外側への細胞の広がりが見られた。
5. 液体中の無性的な細胞集合で、KAX3で見られたストリーム状の細胞集合塊が全く見られず、細胞集合体を形成するのに非常に時間がかかった。
   krsA^-にKAX3を混合すると、KAX3と非常に近いストリームが観察されたが、その後ストリームは分解してしまい、小さな細胞集合体を形成した。
6. 寒天培地上での無性発生で、集合過程で形成されるストリームとマウンドが大きい傾向が見られた。krsA^-で形成された大きなマウンドは、その後いくつかのマウンドに分解して、KAX3と同様の子実体を形成した。