Emiliania huxleyiにおけるC₂代謝経路の解析

背景・目的
　光合成炭素固定反応を行う酵素であるRibulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase(Rubisco)は、CO₂だけでなく、オキシゲナーゼ活性によりCO₂と競合的にO₂も固定する。 このオキシゲナーゼ活性に由来する産物はC₂化合物であるグリコール酸であり、そのグリコール酸の生成を含む代謝過程をグリコール酸(C₂)代謝経路という。 緑色植物型C₂代謝経路では、グリコール酸を代謝し、再びその産物をカルビン・ベンソン回路(C₃回路)に戻すことによって、2分子のグリコール酸からその3/4の炭素を回収する。 緑色植物では、Rubiscoの周囲のCO₂濃度を局所的に上昇させ、オキシゲナーゼ活性を抑制するシステム(CCM)を有しており、環境条件の変化に応じてグリコール酸の生成と代謝を調節する仕組みが発達している。
　Emiliania huxleyiはハプト植物門に属する海洋性微細藻類の一種である。 また、海洋において大規模なブルームを形成し、大量の炭素を固定するため、地球上の炭素循環に与えるインパクトが大きい。本研究室の先行研究において、E. huxleyiに対して、緑色植物型グリコール酸代謝経路の阻害剤であるアミノオキシ酢酸(AOA)を加えて代謝を抑えても、グリコール酸の蓄積や細胞外への放出を確認できなかった。 このことから、E. huxleyiは緑色植物型のものとは異なるC₂代謝経路をもつと推測されたが、詳細については未だ明らかにされていない。 そこで、本研究はE. huxleyiにおけるC₂代謝経路が存在するか否かを明らかにすることを目的とした。

方法
(1)酸素濃度変化に伴う¹⁴C-代謝産物の解析
　 　E. huxleyiにNaH¹⁴CO₃を基質として添加後、1分間大気条件(20% O₂)で培養することで、Rubiscoの基質であるRuBPおよび他のC₃回路の中間産物を¹⁴Cでラベルした。 その後通気条件を、オキシゲナーゼ活性が促進される100% O₂条件とその反応を抑制する100% N₂条件に移行させた。 各条件で一定時間細胞を培養した後、フィルターで細胞を回収することで反応を停止させた。 その後細胞内低分子化合物を80％ メタノールで抽出し、可溶性画分を薄層クロマトグラフィーで分離し、BASにより放射活性を検出した。 また、物質の同定は化学的発色およびRf値で行った。
(2)¹⁴C-グリコール酸を基質としたトレーサー実験
E. huxleyiの培地中に¹⁴C-グリコール酸を添加し、大気条件で一定時間培養した後に反応を停止し、(1)と同様に反応生成物を抽出、分離、同定した。

結果と考察
(1)酸素濃度変化に伴う¹⁴C-代謝産物の解析
　100% N₂、および100% O₂通気条件における¹⁴C-生成物を比較すると、100% N₂条件下では、リン酸化合物(未同定)、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、グリシン、アラニンが主にラベルされた。 一方、100% O₂条件では、同様の化合物の他にグリコール酸も検出され、さらにグルタミン酸、グルタミンおよびセリン/グリシン量が増加した。
(2)¹⁴C-グリコール酸を基質としたトレーサー実験
　E. huxleyiに¹⁴C-グリコール酸を基質として与えたところ、 1、2、5分後では¹⁴C-グリコール酸は検出されたが、その代謝産物は検出されなかった。 しかし、10分後では、¹⁴C-グルタミン酸と¹⁴C-グルタミンが検出された。
　以上の結果から、E. huxleyiは、グリコール酸をグリシンとセリンではなく、グルタミン酸とグルタミンへ代謝していることが明らかになった。 緑色植物では、グリコール酸はグリシン、セリンに代謝され、グルタミン酸やグルタミンへ代謝されることはない。 従って、E. huxleyiが、緑色植物とは異なるC₂代謝経路を有することが、より確実に、代謝産物のレベルで明らかになった。 今後、その代謝経路の詳細を明らかにする必要がある。


　　
Fig. 1　¹⁴C-NaHCO₃を基質とした場合の光合成産物の薄層クロマトグラフィーによる分析
100% O₂通気条件(2分)


Fig. 2 ¹⁴C-グリコール酸を基質とした場合の代謝産物の薄層クロマトグラフィーによる分析
A 5分間反応
B 10分間反応