つくば生物ジャーナル　Tsukuba Journal of Biology (2006) 5: TJB200601200200745

クラミドモナスの細胞内電位の測定

三枝　悠（筑波大学生物学類４年）　　指導教員：吉村　建二郎（筑波大学生命環境科学研究科）

［背景と目的］
　単細胞緑色藻類のクラミドモナスは、走光性や光驚動反応（フラッシュのような短時間で強い光刺激を受けると、一時的に後退遊泳をする反応）という光に対する行動をとる。これらの行動は、次のような経路で鞭毛打が変化し遊泳方向が変化することによって、発現する。すなわち、眼点が光を受容するとチャネル一体型ロドプシンが内向きのCa²⁺電流を発生し、細胞内電位が脱分極する。この脱分極により鞭毛のCa²⁺チャネルが開いてCa²⁺が流入し、鞭毛内Ca²⁺濃度が上昇する。このCa²⁺濃度の変化によって鞭毛打が変化する、と考えられている。しかし、クラミドモナスの細胞体が小さいことから細胞内電位の測定は行われておらず、クラミドモナスの電気的な膜興奮については推測に基づく部分が多い。本研究では、光応答時の電位変化を記録・分析することを目標に、微小電極の刺入に耐える巨大なクラミドモナスを作製して、細胞内電位を直接測定した。
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1.　大きな細胞の作製
　大きな細胞を得るために、ジメチルスルホキシド（DMSO）により細胞質分裂を阻害する方法と、細胞質分裂の突然変異体の利用を検討した。野生型および細胞壁欠損の突然変異体cw2を、DMSOを2.5%となるように加えた液体培地で培養した。また、細胞質分裂異常の突然変異体gchC4を通常の液体培地で培養した。３日目以降の観察で、表１に示した値の直径の細胞が見られた。

表１　大きくなった細胞の直径[μm]

	野生型	cw2	gchC4
-DMSO	10～15	16～32	19～36
+DMSO	13～26	15～26	ー

　野生型の結果から、DMSOにより細胞の体積が大きくなることが明らかになった。その原因については検証を行っていないが、細胞質分裂が阻害される、液胞や小胞体による体積調整が阻害される等が考えられる。cw2ではDMSO存在下で対照群よりも大きな細胞が見られなかった理由は、細胞壁欠損により膨圧や振動に対して極端に弱くなっており、大きくなった細胞の大部分が破裂してしまったためと推測される。
　gchC4では野生型やcw2よりも直径３０μm以上の細胞の割合が比較的高いこと、DMSOを加える必要がないこと、cw2よりも細胞が丈夫であることから、細胞内電位の測定にはgchC4を用いた。

2.　細胞内電位の測定
　通常は細胞膜直下に葉緑体があるため、細胞に電極を刺入すると葉緑体に刺さってしまう可能性が高い。そこで、葉緑体を退縮させるため、黒い箱にフラスコを移して遮光培養した。その結果、細胞体に対して葉緑体が小さくなった。この細胞を細胞壁溶解酵素で処理し、生理的塩類溶液中で、微小電極を先端が葉緑体に達しないように刺入して細胞内電位を測定した（図１）。測定時は赤色フィルターを付けて観察し、照明が刺激にならないようにした。得られた測定値は-56～-12 mVで、そのヒストグラムを作成すると図２のようになった。この結果から、静止状態のクラミドモナスの細胞内電位は-50～-40 mVであると考えられる。分極が-30 mVよりも小さい測定値は、1)電極の角度が浅く、刺入する際に電極を細胞表面に押し付ける形になって細胞を傷つけてしまった、2)弱った細胞の電位を測定してしまったものと考えられる。
　測定した電位が細胞内電位であることを確かめるため、測定中に細胞外液のK⁺濃度を変化させた。電極を刺入した状態で溶液中に50～100 mMとなるように KCl 100 μlを加えたところ、ゆっくりとした脱分極が記録された。定量的な実験はこれから行う予定であるが、一般的に細胞外K⁺濃度が高いほど脱分極することから、この結果は測定値が細胞内電位であることを支持していると考えられる。
[まとめと今後の展望]
　本研究により、モデル生物のクラミドモナスの細胞内電位を初めて測定することができた。今後は、外液のKCl濃度変化に対する反応の定量的な測定、光刺激に対する細胞内電位の変化を記録・分析する予定である。

図1　作製した細胞に電極を刺入した様子。左上の挿入図は通常の野生型を同倍率で撮影したもの。スケールバー=10μm

図２　細胞内電位の測定値のヒストグラム。n=40