シスチン/グルタミン酸交換輸送体のマウス組織における発現

佐藤 香奈子                    指導教官：坂内 四郎

[背景と目的] 　酸素(O₂)を必要とする生物では細胞内外において常に活性酸素種(O₂^-、H₂O₂、・OH)が発生している。これらは、タンパク質、核酸、脂質などの生体分子と反応して細胞に酸化的傷害をおこす。そのため生物には様々な抗酸化機構が備わっているが、その中でもグルタチオンとその関連酵素系は酸化ストレスに対する細胞の防御機構において重要である。グルタチオンはγ-L-グルタミル-L-システイニルグリシンともいいグルタミン酸、システイン、グリシンの３つのアミノ酸で構成されている。培養細胞においては、グルタミン酸とグリシンは細胞内に豊富に存在するが、システインはあまり合成されず存在量が少ないため、グルタチオン合成において律速因子となるのは細胞内のシステイン濃度である。システインは細胞外で容易に空気酸化されてシスチンになるので、細胞はx_c^-系とよばれるアミノ酸輸送系によって細胞内にシスチンをとり込み、その後シスチンは還元されてシステインに戻る。このx_c^-系のアミノ酸輸送の様式は、シスチンとグルタミン酸を基質とした交換輸送である。x_c^-系の活性発現には細胞表面抗原である4F2hcと新規のタンパクであるxCTの発現が必要であることがわかっている。xCTがクローニングされ、LPS刺激したマクロファージや腹腔滲出好中球ではxCTの発現がみられた。また、培養細胞をSH基反応性試薬などで処理した場合もxCTの発現がみられる。一方、組織からとりだしたばかりの肝細胞や、リンパ球にはx_c^-系の活性はない。生体内でのxCTの発現についてはわかっていないが、x_c^-系の生理的意義を理解するうえで生体内での発現を調べる事は重要である。

[方法] 　Northern blot による解析により、組織におけるxCT mRNA の発現量が非常に少ないことがわかってきたので、Nortern blot よりも検出感度がよいとされるRNase Protection Assay を用いてxCTと4F2hcのmRNAの検出を行った。
　8週令のマウスの組織から抽出したtotal RNAとxCT、4F2hcそれぞれの³²P-labeled RNA probe とを14時間Hybridizeさせた後、RNaseによってハイブリしなかったRNAを分解し、電気泳動にかけてバンドをオートラジオグラフィーで検出した。

[結果と考察] 　RNase Protection AssayによりxCTのmRNAが検出できた組織は、大脳、小脳、胎盤(E14)、精巣、骨髄、胸腺、脾臓、肺であった。特に大脳、小脳、胸腺では強いシグナルが検出できた。一方でmRNAの検出ができなかった組織は、肝臓、膵臓、心臓、腎臓であった。4F2hcのmRNAは今回対象としたすべての組織においてその発現が確認できた。以上の結果より、xCTのmRNAが発現している組織、すなわちx_c^-系の活性が発現しているであろう組織は血球系(リンパ系)の組織や生殖系の組織、また酸素消費量の多い脳や高い濃度の酸素に接する肺であることがわかった。これらの組織におけるx_c^-系の発現はグルタチオンレベルの維持に寄与しており、酸化ストレスに対する一種の防御機構を確立していると考えられる。
　今回は正常組織においてxCT mRNAの存在を調べたが、x_c^-系が生体内における抗酸化機構に重要な働きを担っていると予想されるので、in vivo でより多くの活性酸素が発生する系、例えば炎症などにおいてxCTの発現がみられるか検討していきたい。