９６９０１４ 大沢 涼子 指導教官：沼田 治
材料と方法：
当研究室で以前に、Alexander細胞にcre-loxPのユニット、G４１８耐性遺伝子（neo)、T６JのScFv、BSD耐性遺伝子等を含むプラズミドベクターをトランスフェクションによって導入した細胞（pCALNLTS7KRB2-1細胞：G418耐性）を作成した。（大場先生）このうち、T6J遺伝子の発現をオンにするためにcreを発現させ、ストップ配列、G４１８耐性遺伝子、loxP因子をひとつ欠落させた細胞(pCALNLTS7KRB2-1DL5：ブラストサイジン耐性)を使用。Cre酵素により切り出されて失われた遺伝子のユニットをもつプラズミドベクターを４種類作成し、Cre酵素の遺伝子を含むプラズミドとのコトランスフェクションによって再びT６J遺伝子をオンにする前の、もとの状態の細胞に戻すことを試みた。
結果と考察：
まず、始めにpTZLNL ( CAG promotor , loxP , neo＜G418耐性となる＞ , loxPを持つ）、pTZLN ( CAG promotor , lox , neo ) , pTZLHL ( CAG promotor , loxP , ハイグロマイシン耐性遺伝子 , loxP ) , pLNL8 ( loxP , neo , loxP ) という４種類のプラズミドベクターを作成し、大腸菌内で増幅させ、精製したものをそれぞれCre酵素を発現するpXCANCreというプラズミドベクターとともに様々な条件下でコトランスフェクションし、それぞれのクローンを得ることができた。これらの得られた細胞は、トランスフェクション前にはブラストサイジン耐性であったが、トランスフェクション後にneo遺伝子の発現によりG４１８耐性になったものである。これらの細胞は、pCALNLTS7KRB2-1細胞と同じ特性をしめしており、これらの解析を進めていった結果、cre-loxPシステムによってオンにしたものを再びオフの状態に戻すことが可能であることが予測できた。４種類のプラズミドごとに得られたクローン数を条件ごとに比較し、その結果、再組み込みのおこる最適の条件はpXCANCREと目的遺伝子を含むプラズミドを１：１００の割合でコトランスフェクションしたとき、最も多くのクローン数を得ることができた。また作成した４種のプラズミドのうちでloxP配列をひとつだけ含んでいるpTZLNというものを使用したときに最も多くのクローンが得られた。この結果からloxP因子がひとつであれば、オンになった細胞をもとのオフの状態に戻すことが比較的効率よく行えることが推測される。また、得られたクローンの解析を行い、コトランスフェクションを行ったことにより、目的位置に目的の遺伝子が導入されていることが推測できる結果を今回の実験系で得ることができた。