枯草菌DEADボックス型RNAヘリカーゼ相 同遺伝子の機能解析

吉野桂子　　指導教官：中村幸治　責任教官：山根國男

＜目的＞
　DEADボックス型RNAヘリカーゼは、RNA分子の構造変化を引き起こす因子で、翻訳開 始やRNAスプライ シングなどのRNAが関与する様々な生体内機構において重要な働きを 持つことが知られている。その機能に ついては、主に酵母などの真核生物で解析が進 められているが、原核生物においては報告例が少なく、機能 も未知なものが多い。そ こで、原核生物におけるDEADボックス型RNAヘリカーゼの機能を明らかにするこ とを 目的として、ゲノムの全塩基配列が決定されている枯草菌を用いて、DEADボックス型 RNAヘリカーゼ 相同遺伝子を検索し、機能解析を行った。
＜方法＞
　最初に報告されたDEADボックス型RNAヘリカーゼであるマウスのeIF-4A(e ukaryotic initiation factor-4A)のアミノ酸配列を用いて、枯草菌全ORFに対するホモ ロジー検索を行っ た結果、DEADボックス型RNAヘリカーゼファミリーに保存されてい る8つのモチーフを持つ5つの ORF(yxiN, ydbR, yfmL, yqfR, yprA ;)が見い出された。これら、５種類のORFについて、(1)発現洋式、 及び、(2)ATPase 活性について解析を行った。
【1】発現パターンの解析
　各遺伝子の発現パターンを調べるために、胞子形成培地(2xSG)で培養した枯草菌野 生株(168trpC2)から全 RNAを抽出し、それぞれの遺伝子のN-末端側約300bpをプローブ に用いたノーザン解析を行った。
【2】各タンパク質のATPase活性におけるRNA依存性の検討
　DEADボックス型RNAヘリカーゼの多くは、RNA存在下においてATPase活性の上昇を示 すことが知られて いる。そこで、枯草菌の各タンパク質について、同様の特性を示す かどうか調べるために、まず、6xHis-タ グを付加した各タンパク質を、大腸菌を用い て大量調製した。次に、これらのタンパク質を、枯草菌の全 RNAの存在下及び非存在 下において、[γ-³²P]ATPと混合し、遊離したリン酸(Pi)を 液体シン チレーションカウントにより測定した。
＜結果・今後の展望＞
【1】ノーザン解析の結果、各相同遺伝子はいずれも栄養増殖期において発現してい た。また、yqfR, yfmL, yprAはオペロンを形成していると考え られた。
【2】各タンパク質のATPase活性を測定した結果、全てのタンパク質はATPase活性を 示した。さらに、 YdbR, YfmLは、RNAに依存したATPase活性の上昇を示した。

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