清水川 理恵 （筑波大学 生物学類 ４年） 指導教官：八神 健一 （筑波大学 基礎医学系) 杉山文博 （筑波大学 基礎医学系)
＜目的と背景＞
マウス胚性幹細胞（ES細胞）は、胚盤胞内部細胞塊（ICM）を白血病抑制因子（LIF）添加培地で培養することで樹立可能な培養細胞である。ES細胞は、さまざまな細胞を作り出す能力、すなわち、多分化能を持っており、今日では遺伝子改変マウス作製の道具として、分子生物学の分野で広く普及している。
従来、胚性奇形腫を形成しやすい１２９系統と呼ばれるマウス系統を中心として、ES細胞の樹立が行われてきた。しかし、これらのES細胞を用いて得られたノックアウトマウスは、C57BL/6Jの遺伝的背景で表現形質を評価する傾向があり、１２９系統の遺伝的背景を排除するためC57BL/6Jへ１０世代ほど戻し交配をかける必要が生じ、時間の損失が非常に大きいな問題となる。また、再生医療へ基礎研究のため様々な系統のマウスよりのES細胞樹立が要求されてきている。
今回、私は汎用されている近交系マウスの一つである、C57BL/6Jを用いて生殖系列移行が可能なES細胞の樹立を試みた。
＜方法＞
C57BL/6Jの胚盤胞由来のICMを、マイトマイシンCで処理したBALB/c由来の胚性繊維芽細胞（フィーダー細胞）上にて培養した。培地には、ダルベッコ変法イーグル培地（GIBCO）に、LIFのほかに、１５％Knockout
SR（KOSR）（GIBCO）、2-メルカプトエタノール(SIGMA)、非必須アミノ酸(GIBCO)を添加したものを用いた。
培養後、4日たったICMは、ガラスピペットを用いて単離し0.25％トリプシンで処理した後にフィーダー細胞上に播種し継代を行った。コロニー形成ごとにこの作業を行い、4回目の継代で得られた細胞をES様細胞とした。
ES様細胞が果たしてES細胞特有の性質を示すのか、以下の実験を行い検討した。
（１）
増殖活性を評価するため、アルカリフォスファターゼ活性の検出を行った。
（２）
ES細胞マーカー遺伝子の発現の有無をRT-PCR法を用いて検定した。
（３）
マイクロインジェクション法によりキメラ形成能を解析した。
＜結果・考察＞
25個の胚盤胞から3ラインのES様細胞が樹立された。内1ラインは微生物の汚染が生じたため維持を断念した。残り2ラインは7代目以降にてES細胞の分子生物学的な特質を検査した。結果、2ラインともアルカリフォスファターゼ活性は陽性、ES細胞のマーカー遺伝子であるOct3/4、Osteopontin、CD9、PECAM、Utf1、Sox2、の発現も確認された。
次に、多分化能をin vivoで検定するためマイクロインジェクション法によりICRマウス8細胞胚もしくは胚盤胞とES細胞とによるキメラ胚を作製後、偽妊娠マウスに移植しキメラマウスの発生を検討した。結果、両ラインともキメラマウスが発生し、ES細胞の多分化能が確認された。さらにC57BL/6J由来の高キメリズム個体も得られ、ES細胞の生殖系移行が期待された。
今後、キメラマウスの交配実験によってES細胞の生殖系移行を確認する予定である。